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大分子药物PK分析

大分子药物PK分析

2023-04-07 13:18:40
技术文章
作者: SGS_LSS
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法规对于验证主要参数有哪些新要求?我们共同来探讨一下。

大多数情况下,微量滴定板用于LBA,研究样品需按照方案、研究计划或SOP中规定使用每个样品1个或多个孔的分析格式进行分析,且样品分析时需与方法开发及验证保持相同的分析格式。如果每个样品使用多个孔,则应通过计算重复孔响应的平均值或通过平均每个响应计算的浓度来确定可报告的样品浓度。

1. 校准曲线和其范围

校正标样应在与研究样品相同的生物基质中制备。校准范围由最低校正标样(LLOQ)和最高校正标样(ULOQ)定义。在方法验证期间和每次分析运行期间,应为研究的每个分析物提供一条校准曲线。如果需要使用替代基质,应具有科学合理性。

应使用至少6个浓度水平的校正标样(包括LLOQ和ULOQ)以及空白样品生成校准曲线。空白样品不应包括在校准曲线参数的计算中。浓度低于校准曲线LLOQ且高于ULOQ的锚定点样品也可用于改进曲线拟合。锚定点没有接受标准,因为它们超出了曲线的可量化范围。

最好使用分析当天配制的校正标样制备校准曲线。如果未使用新鲜的校正标样,则可在规定的稳定期内使用冷冻的校正标样。

2. 准确度和精密度

用于制备QCs的稀释系列应完全独立于用于制备校正标样的稀释系列。可使用相同的储备溶液(或工作原液)制备,前提是已验证准确的制备和稳定性。应在校准曲线范围内至少5个浓度水平下制备QCs即在LLOQ、LLOQ的三倍范围内(低浓度QC)、校准曲线范围的几何平均值周围(中等浓度QC)以及至少75%的ULOQ(高浓度QC)和ULOQ处添加分析物。

准确度和精密度应在至少2天至少6次运行中,在每个QC浓度水平(LLOQ、低浓度QC、中等浓度QC、高浓度QC、ULOQ)下,每次运行至少分析3个重复来确定。报告的方法验证数据以及准确度和精密度的测定应包括获得的所有结果,但错误明显且记录在案的情况除外。

3. 选择性/基质效应

选择性应在最可能出现问题的分析低端评估,但建议在较高分析物浓度下也评估选择性。因此,使用从至少10个单独来源获得的空白样品,并通过在LLOQ和高浓度QC水平下添加单独空白基质来评估选择性。在稀有基质的情况下,可以使用较少的来源。

应评估血脂样品的选择性,至少使用一种基质来源。为了具有科学意义,用于这些测试的基质应尽可能代表预期的研究样本,应该从献血者处获得甘油三酯含量异常高的天然血脂基质或在基质中可以掺入甘油三酯。然而,如果药物影响脂质代谢或预期患者群体患有高脂血症,则不鼓励使用加标样品。非临床研究无需进行此评估,除非该药物影响脂质代谢或用于高脂血症的特定动物品系。

应评估溶血样品的选择性,至少使用一种基质来源。通过在基质中加入溶血全血(至少2%V/V)来获得溶血基质,以生成明显可检测的溶血样品。应在相关患者群体的样本中评估选择性,至少有五名患者。

4. 特异性

特异性与LBA中的交叉反应性概念有关。重要的是,结合试剂与目标分析物特异性结合,但不会与共存的结构相关分子(例如内源性化合物、异构体或结构相关的伴随药物)发生交叉反应。通过在空白基质样品中加入研究样品中预期结构相关分子的最大浓度来评估特异性,研究LLOQ和ULOQ下目标分析物的准确性。

如果出现非特异性,应通过增加空白基质中干扰分子的浓度并测量LLOQ和ULOQ下目标分析物的准确度来评估对方法的影响。必须确定发生干扰的相关分子的最小浓度。

在方法开发和早期方法验证期间,这些“相关分子”通常不可用。原始验证完成后,可进行额外的特异性评估。

5. 稀释线性与钩状效应

由于许多LBA的分析范围较窄,研究样品可能需要稀释,以便在分析范围内达到分析物浓度。评估稀释线性是为确认测量浓度不受校准范围内稀释的影响,以及校准曲线ULOQ以上的样品浓度不受钩状效应(即,分析物高浓度引起的信号抑制)的影响,从而产生错误结果。

应使用与研究样品相同的基质制备QCs进行稀释。稀释线性应通过生成稀释QC来证明,即用高于ULOQ浓度的分析物加入基质,分析未稀释(为了钩状效应)和用空白基质稀释的至校准浓度范围内的样品(至少3个不同的稀释因子)。对于测试的每个稀释因子,应使制备至少3个独立的稀释系列。在稀释QCs中检查是否存在响应降低(钩状效应),如果观察到并且无法通过合理措施消除,则应在分析研究样品期间采取措施减轻该影响。

研究样品分析期间应用的稀释因子应在验证期间评估的稀释因子范围内。

6. 稳定性

稳定性评估是为确保样品制备、处理和分析过程中采取的每一步以及使用的储存条件不会影响分析物的浓度。

用于稳定性试验的储存和分析条件,如样品储存时间和温度、样品基质、抗凝剂和容器材料,应反映用于研究样品的条件。参考文献中公布的数据被认为是不够的。储存期的验证应通过储存时间等于或长于研究样品的QCs来验证。

用于稳定性试验的校准曲线是分析当天新鲜配制的。虽然使用新制备的校正标样和QCs是首选方法,但在某些情况下,对于大分子,可能需要将其冷冻过夜。在这种情况下,应提供有效的理由,并证明冻融稳定性。QCs应在冻融循环之间至少冻结12小时。

由于校准曲线范围狭窄,许多LBA方法可能需要样品稀释,因此研究样品的浓度可能始终高于校准曲线的ULOQ。如果是这种情况,考虑到应用的样品稀释度,应调整QCs的浓度,以代表实际样品浓度范围。

对于固定剂量的组合产品和专门标记的药物方案,基质中分析物的冻融、台面和长期稳定性试验应在基质中加入所有给药化合物的情况下进行,具体视情况而定。

对于生物药物如果在-70/-80°C和-20°C下证明了稳定性,则无需在储存研究样品的这两个温度点之间调查稳定性。

7. 平行性

平行性定义为校准曲线和连续稀释研究样品之间的平行关系,以检测稀释对分析物测量的任何影响。通常,由于在方法开发或验证期间研究样品不可用,这些实验应在研究样品分析期间进行。应使用空白基质将高浓度(最好接近Cmax)的研究样品稀释校准范围内至少三个浓度(包含在校准范围内)。稀释系列样品之间反算浓度的一致性不得超过30%CV。然而,当应用30%的标准时,应仔细监测数据,因为通过该标准的结果仍可能显示出不平行的趋势。如果样品没有线性稀释(即,以非平行方式),则应事先确定报告结果的程序。

以上就是法规对于PK分析全面验证参数的要求。这些验证参数的接受标准通过准确度和精密度分析确定,法规规定加入分析物的校正标样、质控样品和验证样品的精密度≤20%(ULOQ和LLOQ水平≤25%),准确度在±20%范围内(ULOQ和LLOQ水平在±25%范围内)。

SGS生物分析中心完全具备开展全面方法验证的实力,各位专题负责人都拥有多年方法开发和方法验证的经验,他们主导或参与过的生物药分析方法的验证均接受过国家局或申办方的审查。欢迎各合作伙伴参观考察。

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